白癜风是怎么样引起的 http://baidianfeng.39.net/bdfby/yqyy/摘要：目的克隆丹参Salviamiltiorrhiza转录因子基因SmWRKY14，分析其在不同组织及应答环境因子和植物激素过程中的表达特征。方法以丹参转录组数据中Unigene（c_g1）序列为参考，利用PCR扩增获得SmWRKY14基因序列。通过生物信息软件及在线工具预测基因编码蛋白的理化性质、蛋白质结构等分子特征，采用DNAMAN和MEGA6.0分别进行氨基酸多序列比对和进化树构建，运用实时荧光定量PCR检测该基因的表达模式。结果克隆得到SmWRKY14基因cDNA全长bp，编码个氨基酸，相对分子质量，等电点8.19。该蛋白含有WRKY特征基序，不含信号肽及跨膜结构域，其高级结构主要由无规卷曲构成。进化树分析表明SmWRKY14蛋白与柿WRKY14蛋白的亲缘关系最近。SmWRKY14基因在丹参中各器官中为组成型表达，且该基因与丹参酮合成关键酶基因DXS、GGPPS、CPS的表达模式相似，且受茉莉酸甲酯、脱落酸、赤霉素等植物激素及机械损伤的强烈诱导。结论获得丹参SmWRKY14基因序列、生物信息及表达特征，为研究WRKY家族成员调控丹参酮类化合物的合成、应答植物激素及参与防御反应的分子机制提供理论依据。
丹参SalviamiltiorrhizaBge.是我国重要的药用植物之一，属唇形科鼠尾草属，其根和根茎可入药[1-2]。丹参含有丰富的活性成分，以丹参酮IIA、丹参酮I等为代表的丹参酮类化合物被广泛应用于心脑血管疾病、炎症甚至癌症的治疗[3-5]。作为“模式药用植物”，丹参基因组及多个转录组数据被报道，其遗传背景逐步解析。在此基础上，大量丹参酮和丹酚酸合成途径上关键酶基因被克隆[6-10]，多个具有调控功能的转录因子家族如MYB、bHLH、SPL等被报道[11-14]，这些研究成果为运用分子生物学技术调控丹参的次生代谢过程提供了研究依据。
植物特有的WRKY转录因子家族参与调控植物响应多种环境因子及生物胁迫，例如干旱、高温、盐胁迫、病虫害入侵等生理过程[15-16]。WRKY转录因子家族最重要的结构特点是含有保守的DNA结合区域，该结构域由大约60个保守的氨基酸序列组成，其中由WRKYGQK构成WRKY的核心保守区[17]。并且，WRKY蛋白能够特异识别并结合基因启动子区域的顺式所用元件W-box发挥其转录调节作用[16,18]。
Ishiguro最先从红薯中克隆WRKY基因[19]，随后，绿藻、苔藓、拟南芥、玉米、水稻、葡萄、番茄、大豆等多种植物的WRKY基因纷纷报道[20-26]。研究表明，WRKY基因能够响应环境中生物因子和非生物因子的胁迫。过表达GmWRKY27基因的拟南芥耐寒性显著提高；过表达GmWRKY54显著提高了拟南芥对盐胁迫和干旱的耐受力[27]。同时WRKY基因还参与植物响应UV-B、强光照等非生物胁迫[28-29]。另外，WRKY基因在植物次生代谢产物合成和植物的防御反应中发挥调控作用。例如，棉花中WRKY1参与棉花中棉酚的合成[30]；长春花WRKY1参与长春花碱的合成[31]；烟草中的WRKY6则参与挥发性萜类物质的合成，可能与防御过程相关[32]；辣椒中的WRKY40参与抵御Ralstoniasolanacearum入侵的过程[33]。此外，WRKY基因也参与调控种子萌发、开花、果实成熟等发育过程[34-37]。
为研究转录因子WRKY在丹参次生代谢合成以及应答环境胁迫中的功能，本研究在对丹参进行转录组测序的基础上[38]，经分析比对获得unigenec_g1。以此序列为模板设计引物，克隆得到丹参WRKY基因cDNA序列，命名为SmWRKY14，并对其编码蛋白理化性质、蛋白结构、进化树等进行生物信息学分析，并对其在丹参不同部位以及不同处理下的表达模式进行研究，为进一步深入研究该基因功能提供研究依据。
1材料
丹参种子采自陕西省植物研究所药用植物园，经陕西省西安植物园黎斌副研究员鉴定为唇形科鼠尾草属植物S.miltiorrhizaBge.的种子。
pMD-19TSimple载体购自大连TaKaRa生物公司，DH5α为实验室保存。植物TotalRNA提取试剂RNAisoforPolysaccharide-richPlantTissue、反转录试剂盒PrimeScript?IIReverseTranscriptase、T4DNA连接酶购自宝生物工程（大连）有限公司（TaKaRa）；FastStartUniversalSYBRGreenMaster，购自上海罗氏制药有限公司；质粒提取试剂盒购自OMEGAEngineering，Inc.；普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、高纯度质粒大提试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司。
2方法
2.1植物材料
将种子置于铺湿滤纸的培养皿上萌发，之后转入培养基质（蛭石∶草木灰1∶1.5）中进行培养，培养条件：每日光照16h，温度（25±2）℃；光照强度lx；湿度80%；黑暗8h，温度（25±2）℃，湿度60%。培养30d后的丹参幼苗用于核酸提取及赤霉素（GA3）、脱落酸（ABA）、机械伤害、茉莉酸（JA）处理[39]。丹参根、叶、茎、花组织取自温室培育的两年生丹参植株，采集后立即用液氮速冻；将根组织的周皮、韧皮部及木质部分离，立即液氮速冻；将速冻的植物材料放在?80℃冰箱保存。
2.2总RNA提取与反转录
按照RNAisoPlus植物总RNA提取试剂盒（TaKaRa公司，中国）说明书所述方法提取丹参根、茎、叶、花等各组织总RNA，利用NanoDropTMc分光光度计（ThermoFisher公司，美国）检测所提总RNA的浓度与纯度；将样品总RNA按照PrimeScript?IIReverseTranscriptase反转录试剂盒（TaKaRa公司，中国）进行cDNA第一链的合成。
2.3SmWRKY14基因的克隆
搜索实验室保存的丹参转录组数据库中的序列信息获得1条Unigene（c_g1），经比对为丹参WRKY家族基因。在Unigenec_g1的ORF两端设计扩增完整编码区的引物，上游引物SmWRKY-F：5’-ATGTCTGATGCAGACAATTAC-AAGA-3’，下游引物SmWRKY-R：5’-TGGGT-GTTGAAGAAAAGATGAA-3’。以丹参叶片cDNA为模板，扩增SmWRKY14基因全长。PCR反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸60s，35个循环；72℃延伸10min；反应结束后进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒[天根生化科技（北京）有限公司，中国]回收目的条带，并将其连接pMD19-Tsimple载体（TaKaRa公司，中国）后转化至大肠杆菌DH5α，挑取阳性克隆进行PCR验证，无误后送至上海生工测序公司测序。获得的序列经过拼接、比对，获得基因全长序列信息。
2.4SmWRKY14基因生物信息学分析
利用DNAMan软件将测序所得SmWRKY14核酸序列翻译成氨基酸序列，并用DNAStar软件及ProtParam分析核酸及氨基酸序列的组成成分、理化性质。利用Blast（
